PCR技術(shù)的原理與方法

PCR技術(shù)的原理與方法

 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA?？捎糜诨蚍蛛x克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。

PCR技術(shù)的基本原理

一、PCR反應(yīng)成分：

1、模板DNA；

2、引物；

3、四種脫氧核糖核苷酸；

4、DNA聚合酶；

5、反應(yīng)緩沖液、Mg2+等。

二、PCR反應(yīng)基本步驟：

1、變性(denaturation)：通過(guò)加熱使模板DNA的雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙鏈分開而成單鏈的過(guò)程，高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（94℃，30s）。

2、退火(annealling)：當(dāng)溫度降低時(shí)，引物與模板DNA中互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合成雜交分子，低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（55℃，30s）。

3、延伸(extension)：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出與模板DNA鏈互補(bǔ)的DNA子鏈，中溫延伸，DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（70～72℃，30～60s） 

以上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個(gè)循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)n次循環(huán)后，目的DNA以2n的形式增加。

 

PCR擴(kuò)增的基本方法

 

PCR反應(yīng)的成分和作用

總體積：一般為25μl～100μl

一、無(wú)Mg2+buffer：由純水、kcl、Tris組成。Tris用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH值，使Taq酶在偏堿性環(huán)境中反揮活性。kcl可降低退火溫度，但不能超過(guò)50?mmol/L，否則會(huì)抑制DNA聚合酶活性。二、Mg2+:終濃度為1.5～2.0mmol/L，其對(duì)應(yīng)dNTP為200?μmol/L，注意Mg2+與dNTPs之間的濃度關(guān)系，由于dNTP與Taq酶竟?fàn)嶮g2+，當(dāng)dNTP濃度達(dá)到1?mmol/L時(shí)會(huì)抑制Taq酶的活性。?Mg2+能影響反應(yīng)的特異性和產(chǎn)率。、

三、BSA：一般用乙?；腂SA，起著減少PCR管對(duì)Taq酶的吸附作用，對(duì)Taq酶有保護(hù)作用。

四、底物（dNTPs）：dNTPs具有較強(qiáng)酸性，其儲(chǔ)存液用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.5，一般存儲(chǔ)濃度為 10 mmol/L，各成份以等當(dāng)量配制，反應(yīng)終濃度為20～200μmol/L。高濃度可加速反應(yīng)，但同時(shí)增加錯(cuò)誤摻入和實(shí)驗(yàn)成本；低濃度可提高精確性，而反應(yīng)速度會(huì)降低。

五、Taq酶：能耐95℃高溫而不失活，其最適pH值為8.3～8.5，最適溫度為75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA單鏈為模板，以堿基互補(bǔ)原則為基礎(chǔ)，按5’→3’方向逐個(gè)將dNTP分子連接到引物的3’端，合成一條與模板DNA互補(bǔ)的新的DNA子鏈。無(wú)3’→5’的外切酶活性，沒(méi)有校正功能。某種dNTP或Mg2+濃度過(guò)高,會(huì)增加其錯(cuò)配率。用量一般為0.5～5個(gè)單位/100μl。

六、模板：PCR對(duì)模板DNA的純度不要求很高，但應(yīng)盡量不含有對(duì)PCR反應(yīng)有抑制作用的雜質(zhì)存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制劑、能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。模板DNA的量不能太高，否則擴(kuò)增可能不會(huì)成功，在此情況下可適當(dāng)稀釋模板。

七、引物：引物濃度一般為0.1～0.5μmol/L，濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低則得不到產(chǎn)物或產(chǎn)量過(guò)低。引物長(zhǎng)度一般15～30個(gè)堿基，引物過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)降低特異性。其3’末端一定要與模板DNA配對(duì)，末位堿基最好選用A、C、G（因T錯(cuò)配也能引發(fā)鏈的延伸）。

引物G+C約占45～55%，堿基應(yīng)盡量隨機(jī)分布，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不能與非目的擴(kuò)增區(qū)有同源性。

PCR反應(yīng)條件的選擇（影響因素）

溫度參數(shù)：

1、變性：模板變性完全與否是PCR成功的關(guān)鍵，一般先于94℃（或95℃）變性3～10min，接著94℃變性30～60s。

2、退火：退火溫度一般低于引物本身變性溫度5℃。引物長(zhǎng)度在15～25bp可通過(guò)公Tm=(G+C)×4℃+(A+T)×2℃計(jì)算退火溫度，一般退火溫度在40～60℃之間，時(shí)間為30～45s。如果(G+C)低于50%，退火溫度應(yīng)低于55℃。較高的退火溫度可提高反應(yīng)的特異性。

3、延伸：延伸溫度應(yīng)在Taq酶的最適溫度范圍之內(nèi)，一般在70～75℃。延伸時(shí)間要根據(jù)DNA聚合酶的延伸速度和目的擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度確定，通常對(duì)于1kb以內(nèi)的片段1min是夠用的。

循環(huán)數(shù)：

PCR的循環(huán)數(shù)主要由模板DNA的量決定，一般20～30次循環(huán)數(shù)較合適，過(guò)多的循環(huán)數(shù)會(huì)增加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物，具體要多少循環(huán)數(shù)可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定。

PCR產(chǎn)物積累規(guī)律：